快速检测饲料中有害微生物的方法与设备

 　　当前，饲料安全问题已成为全球关注的重要议题，而有害微生物污染也成为饲料安全中的一项主要控制指标。饲料厂有害微生物主要有有害细菌、霉菌、大肠菌群等，它们对饲养动物和动物源性食品危害很大。饲料生产企业在生产过程中普遍存在有害物质，包括有害微生物的交叉污染。要控制饲料原料、产品中有害微生物，首先必须要有能够准确快速的有害微生物捡测方法。经典的标准检测方法往往比较费时，所以有害微生物快速检测方法成为近年来的研究热点。本文根据近年来国内外已发表的研究文献，总结有害微生物快速检测方法的研究进展，供参考。

　　1 饲料中有害微生物快速检测方法研究进展

　　1.1 生物传感器技术

　　生物传感器(biosensor)是指对生物物质敏感并能将其浓度转换为电信号进行检测的仪器;生物传感器又分为：酶生物传感器、微生物传感器和免疫传感器。它们具有成本低、体积小、灵敏度较高的优点;能从腐败或者半腐败的食品、饲料中得到实时而快速、多样化的分析检测结果。

　　张杰等利用生物素——亲和素系统将分子马达与探针连接构建了F0F1——ATPase分子马达生物传感器，它能对副溶血性弧菌特异性识别，最低检测限为1pg/反应体系，对其致病性进行快速诊断，无需热循环反应，检测周期缩短，整个分析过程只需1h——2h，不需酶切及电泳等繁琐操作。

　　张捷等通过生物素——亲和素系统将特异性沙门氏菌特异性基因(invA，作为其目的基因片段)核酸探针连接在F0F1——ATPase的ε亚基上构建生物传感器;将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化三磷酸腺苷(ATP)合成30min后的ATP产生量，依此对样品中的沙门氏菌DNA进行检测。该方法对沙门氏菌DNA的检测时间为1h，检出限为10ng/ml。从分析样本分离得到的30株细菌，利用分子马达生物传感器的检测结果与PCR 检测的结果一致。

　　Kim等为了提高传感器对单增李斯特菌的分析检测能力，设计了与实时的分析系统相连结的IMC模块(immuno——magnetic concentration)。生物传感器技术大大缩短了检测时间，可在数小时甚至数分钟内查出致病微生物，为微生物的快速检测提供了一种有效的工具。但该法在预处理方面受到某些限制。

　　1.2 基因芯片技术

　　基因芯片技术是在生命科学领域迅速发展的新型食源性检测技术。该法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，大大提高了基因芯片的探针密度，且试剂用量减少，可以实现标准化和批量化大规模生产，有很大的发展潜力。将基因芯片技术与其它技术结合起来，能达到更好的效果。

　　戈海泽等根据生物信息学技术以细菌16SrDNA和23SrDNA序列设计各细菌的特异型探针和引物，在基因芯片制备基础上，通过对靶基因的扩增、杂交和对杂交结果的分析，对常见肠道致病菌的检测和鉴定效果进行评价，同时对临床采集100份腹泻患者粪便标本进行细菌培养。在100份临床粪便标本中，采用基因芯片技术共检出50份(50%)携带肠道致病菌;细菌培养鉴定出47份(47%)携带肠道致病菌，其中42份基因芯片与细菌培养结果一致，准确率为79.25%，与细菌培养结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。该该法具有高通量、高准确性和高灵敏度，检测时间短，可同时检测多种有害微生物，可以作为临床鉴定细菌的一个重要的方法。将广泛应用于食品饲料安全控制，突发性食品安全事件检测，出入境检验检疫等，但检测费用昂贵。

　　1.3 聚合酶链式反应技术

　　聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，具有特异性强、灵敏度高、简便快速和对标本的纯度要求低等优势;不过检测样品较多时工作量大。在食品安全越来越严峻的形式下，许多科技工作者试图多种检测方法联用，达到解决上述问题的目的。将多种检测方法联用，旨在弥补单一检测方法的局限性。目前国际上研究的热点有多重荧光实时PCR检测技术，兼具多重PCR和荧光实时PCR技术的实时定量检测监控PCR产物两方面的优点。

　　石建玲等根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针，构建质粒标准品，建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价，对2012——05——10收集的100份临床样本进行检测并同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析发现：检测范围宽，在107copies/l——102copies/l(指1l溶液里面DNA/RNA的拷贝数是多少个)内均呈现良好的线性关系，且相关系数为1;与多种细菌均无交叉反应，特异性好;检测时间短，整个PCR反应过程仅需70min;并可在不同拷贝数的标准品批内重复测定，对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线;实时荧光定量PCR具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。国外也有将酶联免疫吸附测定与PCR技术联用建立有害微生物检测方法的报道，有效的提高了有害微生物的检出率。

　　1.4 生物阻抗法

　　生物阻抗法的原理是利用由微生物新陈代谢引起的培养基电学特性变化快速检出样品中微生物的含量。阻抗法具有能区分活细胞和死细胞的优势，而死细胞常常无致病性，保障食品与饲料安全的关键就是检验活细胞的数量。陈江利用阻抗法检测啤酒有害乳酸菌，630A培养基(奥地利SY——LAB公司)较适合于阻抗法，用E值作为阻抗值变化的判断标准，与传统培养基法检测结果相比，阻抗法的检测结果准确可靠，能够将检测时间缩短至72h。此法检测速度很快，但只能确定污染程度。

　　1.5 蛋白质芯片技术

　　蛋白质芯片技术又称蛋白质(微)阵列，是指将已知的大量蛋白质(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)固定在经化学修饰的固相载体(璃片、硅片等)上，在保留蛋白质物化性质的基础上，蛋白质与载体表面结合，再用激光扫描系统或者电感耦合器件获取相关图像;然后用专门的计算机软件分析图像、定性定量结果。Howell等采用俗称软蚀刻的微接触印刷技术(microcontact printing，CP)制作出了一种可以检测大肠杆菌E。coli O157∶H7及鲑肾杆菌(renibacterium salmoninarum)的抗体微阵列，结果表明：此芯片与其他有害微生物的交叉反应少， 检出浓度为7×107cfu/ml，检测时间是40min，是一种很有效的微生物检测方法。

　　方珍建立了检测E。coli O157∶H7的液相蛋白芯片方法。通过绘制检测曲线，分别应用该方法及H2O作溶解剂的液相芯片方法检测实际牛肉样品。比较该方法与细菌分离培养法的阳性检出率，能检出阳性的最低浓度为103cfu/ml(?菌后)，最低检出限为100cfu/ml;与18种肠道菌无交叉反应，特异性良好;3次重复实验，批间变异系数7.61，重复性良好;应用该方法检测牛肉样品中人工添加细菌，能检出阳性的最低浓度为0.5cfu/ml(增菌前);应用该方法检测154份实际牛肉样品，检出阳性样品19份，而细菌培养法检出阳性样品16份。蛋白质芯片技术是一种高特异性、高灵敏度、高通量、重复性好、应用性强、适用范围广且微型化的分析技术，在生命科学的各个研究领域有很好的发展前景，但同基因芯片技术一样，检测费用高，发展还不成熟。

　　1.6 纳米金标记技术

　　纳米金标记技术是指直径在1nm——100nm金的微小颗粒，具有高电子密度，介电特性和催化作用，可以与多种生物大分子结合，且不影响生物大分子的生物活性。近年来，基于纳米金标记的快速检测研究在有害微生物方面应用比较多，检测的微生物种类也比较多，国内外科技工作者通过对纳米金颗粒表面特性的处理以及在纳米金颗粒表面标记上特定的寡核苷酸探针，开发研究出了新的微生物检测系统。

　　刘霞利用氨基偶联法在传感器表面固定多克隆抗体(PAb)作为一抗，金纳米粒子(AuNPs)标记的大肠杆菌E。coli O157∶H7的多克隆抗体(PAb)作为二抗，通过三明治方法用双通道表面等离子体共振(SPR)传感器对E。coli O157∶H7进行检测。SPR直接法检出限为103cfu/ml，线性范围为103cfu/ml——109cfu/ml;金纳米粒子增强三明治法的检出限为10cfu/ml，线性范围为10cfu/ml——1010cfu/ml，灵敏度提高100倍，检测范围更宽，检测时间缩短，选择性和重现性较好。此技术具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等优点，适合现场筛选，在饲料检测中有着广泛的应用价值和发展前景。

　　2 饲料中有害微生物快速检测设备

　　目前，生物学领域的专家通过对微生物快速检测方面深入的研究，开发了一系列技术，有ATP荧光仪、多功能微生物荧光检测仪、微生物实时光电检测系统、纸片法。这些用于食品中有害微生物的快速检测技术，未来同样可以在饲料中应用，这些方法的应用将为饲料安全提供有力的保障，同时可以促进我国饲料工业的持续健康发展。下面重点介绍常用的两种有害微生物快速检测设备。

　　2.1 RVLM 型微生物快速检测系统

　　由德国皇家生物科技公司生产的高性能便携式微生物检测仪将多种检验方法的优点集合应用，如培养皿法、酶法(β——葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜寻)、基因法(基因搜寻)，具有便捷、操作简单、检验迅速、高灵敏性、高特异性、消耗成本低、定性半定量测量等诸多优点。

　　2.1.1 快速检测对象

　　活菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、肠道杆菌科、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌、霉菌(曲霉属真菌、曲霉菌)、酵母菌、军团菌等，可以定量检测。

　　2.1.2 快速检测产品特点

　　应用范围广：应用于食品、饲料、药品、水质、空气微生物检测等众多领域，可检测固态、液态、气态及膏状、浆状等多种样本。

　　使用方便：一套便携系统即可完成采样、实验、后处理等工作，无需配备多种检测仪器。

　　操作简单：检测样本只需1ml或1g，且无需前处理，只需3个步骤就可完成操作。

　　高灵敏度：可检测到数量级为1cfu的目标微生物，满足国内国际微生物检测标准。

　　高特异性：特异性高达99.999%，杜绝非目标微生物造成的实验干扰。

　　准确度高：可100%定量分析。

　　检测数量：8个插槽可同时提供8项不同实验，13类不同标准培养环境。

　　快速检测：最快10min即可得到检测结果，可用于现场检测。

　　高智能化：能够自动控制孵育温度和孵育时间，并可自动生成实验报告。

　　全自动化：独立、持续地检测并记录瓶中的微生物数量(cfu)。

　　在欧洲的实验室中，80%——90%的微生物检测实验采用的仪器是RVLM 型微生物检测系统，其超高的灵敏度可以满足欧盟及国内检测标准。RVLM型微生物快速检测是目前业内最高端的智能优质微生物检测仪。

　　2.2 ChemScan RDI微生物快速检测仪

　　ChemScan AES Chemunex公司将激光扫描合成成像技术与活细胞荧光酶标记相结合，研制成功ChemScan RDI微生物快速检测仪。该仪器可在1.5h内对可过滤样品中的微生物及原生虫进行快速计数，适于食品、饲料、化妆品及药品行业。其特点：只检测活细胞数，激光对整张滤膜扫描后自动读数，速度极快，无需增菌，可在90min——100min内出结果;可选配荧光显微镜与仪器连接，自动定位对可疑微生物进行确认观察。灵敏度：可检测出1个微生物或原生虫;检测范围：1个——5000个细胞。